Home

Forensische toxicologie

 


Gerechtelijke analyses van drugs, geneesmiddelen en andere potentieel toxische bestanddelen in urine, bloed en andere matrices worden in regel uitgevoerd in opdracht van een magistraat of onderzoeksrechter.

Volgend schema wordt doorgaans doorlopen bij een Systematische Toxicologische Analyse (STA). Een beknopte uitleg over deze werkwijze kan u lezen in de bijhorende tekst.

Wanneer u hierover meer informatie wenst kan u gerust contact opnemen met Prof. Dr. Willy Lambert (tel: 09/264 81 35, e-mail: willy.lambert@UGent.be)

 


Systematische Toxicologische Analyse:

1. Inleiding

2. Screening

3. Identificatie en confirmatie

4. Quantificatie

5. Interpretatie

1. Inleiding

De taak van een gerechtelijk toxicoloog is aan de ene kant intrigerend en aan de andere kant complex en ingewikkeld. Het ganse proces van een gerechtelijke analyse kan ingedeeld worden in vier stappen.

Eerst dient er aangetoond worden of er al dan niet toxicologisch relevante stoffen aanwezig zijn in een gegeven matrix (screening). Vervolgens moeten de gedetecteerde componenten geïdentificeerd worden aan de hand van endogene componenten (identificatie en confirmatie). In een derde stap wordt elke geïdentificeerde component gequantificeerd vooralleer een uiteindelijke interpretatie van zijn toxiciteit (vierde stap) mogelijk is.

Gezien het grote aantal stoffen die mogelijk toxisch zijn of misbruikt worden dient de zoektocht gebaseerd te zijn op een logische analytische aanpak ook wel STA (Systematische Toxicologische Analyse) genoemd.

Een wijd gamma aan immunoassays en een brede waaier aan chromatografische technieken zijn voorhanden om de gerechtelijke toxicoloog in staat te stellen een STA uit te voeren.

Dunne laag chromatografie (DLC), vloeistof chromatografie (HPLC) en gas chromatografie (GC) gekoppeld aan selectieve detectoren zoals massa spectrometer (MS), photodiode array detector (DAD) of Fourier-transform infrarood detector (FTIR) zijn de werkinstrumenten in vele  toxicologische labo’s.

Daarentegen worden ook nieuwe technieken zoals capillaire elektroforese (CE) en capillaire zone elektroforese (CZE) en nieuwe koppelingen zoals vloeistof chromatografie en massa spectrometrie (LC-MS) meer en meer toegepast in de analyse van gerechtelijke stalen.

2. Screening

Het is bijna een vuistregel dat de eerste analyses uitgevoerd in een systematische toxicologische analyse screeningstesten zijn. Screeningstesten bieden de toxicoloog snel en betrouwbaar een ja/nee antwoord op de vraag of er bepaalde drugs of geneesmiddelen of groepen drugs of geneesmiddelen aanwezig zijn in het staal. Spottesten en kleurreacties worden nog steeds gebruikt maar zijn vatbaar voor interferenties die leiden tot vals positieve of vals negatieve resulaten. Bij het screenen blijft de te prefereren methode de immunoassay techniek. Alhoewel methanol of aceton extracten van bloed hiermee kunnen geanalyseerd worden, blijft urine veruit de meest ideale matrix bij het screenen. Immunoassays omvatten meestal geen extractie en hebben slechts een kleine hoeveelheid staal nodig. Bovendien zijn ze gemakkelijk automatiseerbaar. Immunoassays worden gekarakteriseerd door hun hoge gevoeligheid en een matige specificiteit. Deze matige specificiteit wordt wel vaker gebruikt voor het screenen van klassen structureel verwante componenten (vb. amfetamines).

De meest gebruikte immunoassays in forensische analyses zijn de radioimmunoassay (RIA), de enzyme multiplied immunoassay (EMIT),de enzyme linked immunoassay (ELISA) en de fluorescence polarization immunoassay (FPIA). Elk van deze technieken heeft zijn specifieke voor- en nadelen.

3. Identificatie en confirmatie

In de tweede stap van een forensische analyse moeten de positieve resultaten bekomen in de eerste screeningstap geconfirmeerd worden en de stof verantwoordelijk voor het positieve resultaat moet geïdentificeerd worden. Bovendien, en dit is op zijn minst even belangrijk, dient de toxicoloog aan te tonen dat geen enkele andere toxicologisch relevante componenten in het staal aanwezig zijn. 

3.1. Extractie

Gezien de lage concentraties aan toxicologische componenten die over het algemeen in een biologische matrix worden aangetoond en de aanwezigheid van een groot aantal toxicologisch niet-relevante en interferende substanties, is een aanconcentreringsstap in een STA een absolute noodzaak.

Vloeistof-vloeistof extractie is een extractie methode die al sinds jaren wordt gebruikt en nog steeds in de meeste toxicologische labo’s als standaardmethode wordt toegepast. Eénstapsextracties geven in veel gevallen een hoog rendement, maar in het kader van de zuiverheid van het extract zal vaak een terug-extractie noodzakelijk zijn. Het aanpassen van de pH, het gebruiken van verschillende solventen en het inbouwen van een hydrolysestap zijn factoren die een cruciale rol kunnen spelen in het optimaliseren van het extractierendement en het elimineren van interferenties.

Naast de vloeistof-vloeistof extractie wordt nu meer en meer gebruik gemaakt van een vaste fase vloeistof extractie of solid phase extraction (SPE). Solid phase extracties winnen veel aan interesse doordat ze zeer gemakkelijk in gebruik zijn en bovendien gemakkelijk automatiseerbaar zijn. Het pakkingsmateriaal van een SPE-kolom vertoont veel gelijkenissen met het pakkingsmatriaal gebruikt in vloeistofchromatografie (silica of gebonden fasen). De laatst ontwikkelde SPE-extractie kolommen beslaan een dermate grote waaier aan componenten dat ze perfect bruikbaar zijn in het screeningsproces van biologische matrices naar toxicologisch relevante componenten.

3.2. Chromatografie

Dunne laag chromatografie (DLC): Dankzij zijn eenvoud, snelheid en lage kost was de dunne laag chromatografie gedurende jaren zeer populair in standaard toxicologische analyses. Daarentegen hebben zijn laag scheidend vermogen in vergelijking met vloeistof- en gaschromatografie en zijn gebrek aan spectrale informatie er voor gezorgd dat de DLC-techniek als identificatiemiddel langzaam verdwijnt in de toxicologische labo’s.

Nochtans werd aangetoond dat de identificatiekracht van een DLC gevolgd door een specifieke kleurreactie in combinatie met GC of HPLC zeer hoog is. Vooral de grote diversiteit aan sproeireagentia, de specifieke kleurvorming en de mogelijkheid om componenten zichtbaar te maken die ofwel meelopen met het front ofwel in de startvlek blijven zitten bieden onmiskenbaar voordelen. Ook kunnen via DLC componenten die niet UV-actief zijn (en dus niet gedetecteerd worden via HPLC-UV deectie) en die moeilijk gaschromatografeerbaar zijn (b.v. meprobamaat) toch teruggevonden worden.

Vloeistof chromatografie: Het aantal stationaire fases gebruikt in vloeistof chromatografie neemt nog steeds toe en de grote waaier aan verschillende componenten die kunnen geanalyseerd worden aan de hand van deze techniek heeft er toe geleid dat HPLC zijn  toepassing heeft gevonden binnen het domein van de forensische analyses.

Vroeger waren enkel de retentietijden een criterium bij het identificeren van een component. Het on-line koppelen van specifieke detectoren aan een HPLC heeft er echter voor gezorgd dat de confirmatie van een onbekende stof nu niet alleen gebaseerd is op retentietijd maar tevens op spectrale informatie verkregen van de detector. Typische detectoren die gekoppeld werden aan HPLC zijn: UV-detector, fluorescentiedetector, photodiode array detector en massa spectrometer.

Gaschromatografie:  De introductie van de capillaire kolommen heeft  de deur geopend voor het gebruik van gaschromatografie in de forensische analytiek.

De identificatie gebeurde oorspronkelijk op basis van  retentietijden bekomen uit niet-specifieke detectoren zoals vlam ionisatie detector (FID) en meer specifieke detectoren zoals een stikstof-fosfor detector (NPD) en een electron capture detector (ECD). Net zoals bij vloeistof chromatografie heeft de koppeling van meer specifieke detectoren aan een gaschromatografisch systeem de identificatie van onbekende stoffen enorm vereenvoudigd. De spectrale informatie is in het geval van gaschromatografie meestal afkomstig van een infra-rood detector (IR) of een massa spectrometer (MS).

Zonder enige twijfel kan gesteld worden dat GC-MS de referentiemethode is bij de confirmatie van positieve resultaten verkregen uit screeningstesten.

4. Quantificatie

De quantificatie van de geïdentificeerde componenten is gebaseerd op dezelfde chromatografische technieken gebruikt bij de screening en identificatie. Om betrouwbare quantitatieve resultaten te kunnen bekomen dient voldaan worden aan een aantal criteria.

Eerst en vooral is een interne standaardisering aangeraden om fouten te compenseren ten gevolge van adsorptie aan de het oppervlak, verlies gedurende de staalvoorbereiding, onvolledige derivatisering of het niet-reproduceerbaar injecteren.

De interne standaard moet zich gedragen op dezelfde manier als de te detecteren component gedurende de extractie, derivatisatie en detectie maar moet ervan gescheiden worden in het chromatografisch proces. De interne standaard dient een structuuranaloog of een gedeutereerde analoog van de te detecteren component te zijn, zonder dat het gaat om een endogene component of een metaboliet van de component.

Naast een calibratie zal een validatie van een aantal andere analytische parameters  zoals rendement, gevoeligheid, precisie, accuraatheid, selectiviteit en stabiliteit noodzakelijk zijn.

5. Interpretatie

Na de identificatie en quantificatie van de toxische componenten in een biologische matrix dient de gerechtelijke toxicoloog deze quantitatieve resultaten te interpreteren. De interpretatie van drugs of geneesmiddelen kan relatief eenvoudig zijn of zeer complex. De matrix waarin de component werd aangetoond speelt hierbij een cruciale rol. De aanwezigheid van drugs of geneesmiddelen in de urine of in de nier indiceert een blootstelling, maar een duidelijke inschatting van de toxiciteit is onmogelijk. Een quantitatief resultaat van een drug of geneesmiddel in een bloedstaal daarentegen is beter gecorreleerd met de toxiciteit of de fataliteit van een component. In het geval er slechts één toxisch relevante component werd teruggevonden is de interpretatie van het quantitatieve resultaat vrij eenvoudig. De aanwezigheid van verschillende drugs of geneesmiddelen is moeilijker te interpreteren gezien de verschillende componenten een synergistisch effect kunnen hebben.

Niet alleen de hoofdcomponent, maar ook zijn metabolieten en conjugaten zijn relevant bij de interpretatie. Zo kan een hoge hoofdcomponent/metaboliet verhouding een acute dood indiceren.

Een forensisch toxicoloog moet ook in staat zijn de effecten van een drug of geneesmiddel op een individu in te schatten (b.v.: een verminderde rijvaardigheid die kan leiden tot het veroorzaken van een ongeval of een verandering in gedrag die kan leiden tot agressieve daden,...).